科研 | Cell Death Dis.：动态重塑肝细胞外基质可预测早期肝硬化的预后（国人佳作）

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编译：微科盟李可爱，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

到目前为止，肝硬化仍然是全人类面对的主要健康问题。尽管肝硬化在无症状早期的诊断方面取得了进展，但仍需探索预后生物标志物来预测高危肝硬化患者的预后。肝硬化以细胞外基质(ECM)异常重塑为特征，是创面愈合失控的结果。然而，在肝硬化的进行性发展过程中，ECM是如何动态重塑的，目前还没有确切的报道，ECM信号对判断早期肝硬化预后是否有预测价值尚不清楚。在本研究中，我们系统地分析了细胞肝基质的蛋白质组学，并在四氯化碳诱导的肝纤维化的组织损伤/炎症、过渡性ECM重塑或纤维化阶段确定了四个独特的ECM蛋白簇，尤其是在纤维化阶段，基底膜(BM)大量沉积，活化的肝星状细胞中BM成分的次要IV型胶原α5链表达增加。实验表明敲除次要IV型胶原α5链可抑制肝星状细胞活化，促进肝细胞增殖，从而减轻肝纤维化。早期肝硬化患者预后良好和预后较差的活检组织中ECM信号明显丰富，负责动态平衡重建和组织纤维化的ECM蛋白簇，以及基底膜信号与疾病进展和患者生存显著相关，而由基底膜蛋白组成的14个基因信号在预测疾病进展和患者生存方面是有效的。因此，ECM信号可作为肝硬化潜在的预后生物标记物。

论文ID

原名：Dynamically remodeled hepatic extracellular matrix predicts prognosis of early-stage cirrhosis译名：动态重塑肝细胞外基质可预测早期肝硬化的预后
期刊：Cell Death & Disease
IF：6.304发表时间：2021.02通讯作者：李辰、曾嵘、葛高翔
通讯作者单位：中国科学院系统生物学重点实验室

实验设计

实验结果

1. 肝纤维化过程中肝基质蛋白的整体变化

四氯化碳(CCl₄)反复干预可导致肝组织创面反复愈合，使细胞外基质(ECM)沉积紊乱，并逐渐发展为肝纤维化。在CCl₄处理后的第1天，肝损伤表现为肝细胞大量死亡和炎症，出现大量的增殖细胞(图1A)；在CCl₄诱导后1周，肝脏坏死不明显，炎症和细胞增殖停止(图1A)；在CCl₄诱导1周后，开始观察到肝损伤处的弱胶原沉积(图1A)；4周重复的CCl₄诱导，可导致广泛的胶原沉积，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性的肌成纤维细胞积聚(图1A)。纤维连接蛋白的沉积是组织纤维化的早期事件，可为胶原纤维集合体提供了支架。纤维连接蛋白早在CCl₄诱导后1天就沉积了，并在CCl₄诱导4周后大量沉积在纤维化的肝脏中(图1A)。因此，1天、1周和4周的CCl₄诱导代表了肝组织损伤/炎症、过渡性ECM重塑和纤维化形成的阶段。

在肝纤维化发展过程中，ECM经历了动态重塑。非离子脱细胞洗涤剂去除了可溶性的细胞内及细胞外蛋白质，同时保留了不溶性的细胞外基质支架和紧密结合在细胞外基质支架上的蛋白质。随后，我们对肝基质进行富集，并进行深入的蛋白质组学分析，脯氨酸和赖氨酸残基在胶原蛋白和其他ECM蛋白中大量羟化。为了更准确地评估肝损伤过程中基质蛋白的丰度，研究人员在数据库中搜索了包括脯氨酸和赖氨酸羟基化的蛋白质，最终共鉴定出152个基质蛋白，其中4个组中均鉴定出了81个基质蛋白(图1B，C)，每组都产生了不同的ECM蛋白图谱(图1C)，其中7个(LAMA1、LGALSL、MBL、CTSG、MASP1、SERPINB1A、SERPINB9C)和12个(MFGE8、ASPN、CST3、F10、HYAL1、MMP19、P4HA2、SERPINA1C、SERPINA1D、SERPIND1、SERPINF1、NGF)的基质蛋白仅在处理1天和1周时被鉴定。在1天和1周的干预组中，我们发现了另外15个基质蛋白(CRELD2，IGFBP1，TSKU，PRG4，CSTB，F12，HABP2，SERPINA1B，SERPINA1E，SERPINA3N，SERPINA7，SERPINF2，ANGPTL4，CRLF3，S100A8)，但在对照组和4周组中没有发现(图1)，COL15A1和P4HA1仅在4周处理组中被发现(图1C)。基因本体论(GO)分析表明，这些基质蛋白参与了肽酶活性和ECM组织的负调控(图1D)。

图1 四氯化碳诱导的肝纤维化模型中肝基质成分的鉴定
(A)腹腔注射CCl₄ 1天、1周或4周或橄榄油4周的小鼠肝脏的显微镜观察。肝切片行苏木精-伊红(HE)、天狼星红染色或I型胶原(Col I)、纤维连接蛋白(FN)免疫组化染色。标尺：100μm。(B-E)脱细胞和浓缩的肝基质进行质谱分析,在肝纤维化的每个阶段确定基质蛋白的数量。(C)Venn图描绘了四个肝纤维化阶段基质蛋白的重叠。(D)已鉴定的基质蛋白的基因本体论(GO)。(E)已鉴定的基质蛋白的数量。(F)每一个肝纤维化阶段的基质中已鉴定蛋白数量。

2. 肝纤维化中基质亚群的差异性变化

基质由结构ECM蛋白(称为核心ECM)和ECM相关蛋白组成,我们共鉴定出57个核心ECM蛋白(15个胶原蛋白、33个糖蛋白和9个蛋白多糖)和95个ECM相关蛋白(27个ECM相关蛋白、57个ECM调节蛋白和11个分泌因子)(图1E)。已鉴定的糖蛋白、蛋白多糖、细胞外基质附属蛋白和分泌因子的数量在不同组之间的差异具有可比性(图1F)；然而，在1天和1周的CCl₄处理后，已鉴定的胶原蛋白和ECM调节剂的数量发生了巨大变化(图1F)。在1天和1周的CCl₄处理后，我们在肝损伤组织中检测到较少的胶原蛋白(9和11个，对照组和4周组为14个)，而检测到更多的ECM调节剂(45和51个，对照组和4周组为29和34个)(图1F)。GSEA基因集富集分析揭示了CCl₄诱导的肝纤维化过程中核心、基质和基质相关蛋白的动态变化。与对照组相比，在CCl₄处理1天后，我们检测到肝损伤组织中核心基质蛋白的表达显著下调，而基质相关蛋白的表达显著上调。与显著的肝纤维化相一致，在4周的CCl₄诱导后，核心基质组显著丰富，而基质相关蛋白的表达显著减少。在CCl₄诱导的肝纤维化过程中，不同的基质蛋白亚群受到不同的调节，与对照组相比，胶原蛋白和蛋白多糖在处理1天后均有定量下调。胶原蛋白的表达仅在4周后恢复，但不能在1周的CCl₄处理后恢复。与胶原不同的是，蛋白多糖的表达在1周组部分恢复，在4周组进一步增加。与处理1周后进一步上调的对照组相比，细胞外基质调节因子的表达在处理1天组显著上调。细胞外基质调节因子的表达在处理4周后急剧下降。在CCl₄诱导的肝纤维化过程中，糖蛋白、ECM附属蛋白和分泌因子的表达仅有轻微变化。

3. 肝纤维化过程中基质蛋白的动态变化

CCl₄诱导后，肝损伤组织中的基质蛋白的相对丰度发生了变化。基质蛋白定量的聚类分析确定了四个簇(图2A-C)。簇1代表CCl₄处理后1天上调的基质蛋白，主要包括糖蛋白、ECM附属蛋白和ECM调节因子；簇2代表在CCl₄处理后1周上调的基质蛋白，主要包含ECM调节蛋白和ECM附属蛋白；簇3代表在CCl₄处理后1天和1周上调的基质蛋白，主要包含ECM调节蛋白和糖蛋白；簇4代表组织中的基质蛋白在1天或1周时减少，但在CCl₄处理后4周后基质蛋白的相对丰度恢复，主要含有胶原、糖蛋白和细胞外基质调节因子。与CCl₄处理后1天的急性组织损伤/炎症，1周的过渡性ECM重塑，以及4周的纤维化形成的组织学变化一致(图1A)，GO分析显示每一簇都与不同的生物学过程有关(图2D)，簇1包含参与调节组织损伤和免疫反应的蛋白质；簇2和簇3包含参与肽酶活性负调控和细胞外基质重塑的蛋白；簇4含有参与胶原原纤维和细胞外基质组织调节的蛋白质。纤维蛋白原链(FGA、FGB、FGG)和分泌因子S100A8/S100A928在CCl₄处理后1天高表达，但在CCl₄处理后1周这些糖蛋白的表达急剧下降(图3)，其中FGA、FGB、FGG和分泌因子S100A8/S100A928在1天时高表达，而在CCl₄处理后1周这些糖蛋白的表达急剧下降。在处理1天和1周时，层粘连蛋白和周膜蛋白是肝纤维化发展所需的糖蛋白降低，但在CCl₄处理后4周恢复(图1)。V型胶原是一种低丰度的纤维性胶原，它被掺入I型胶原纤维中，以调节I型胶原纤维的大小和形状。与I型胶原相似，V型胶原的表达在CCl₄处理后第1天下降，但在第4周增加(图3)。

肝硬化是慢性纤维化肝病的终末期。除了临床预后变量（如血小板计数和血清胆红素水平）以外，基因信号被用来预测丙型肝炎相关的Child-Pugh A级早期肝硬化患者的预后，并将患者归类为疾病进展到B级或C级晚期疾病、患者死亡的预后差和好的患者。与高危发展为B类或C类晚期疾病的患者(预后不良组)相比，A类早期肝硬化患者最不可能发展为B类或C类晚期疾病的患者(预后良好组)的肝活检组织中簇1、簇2或簇3的表达显著丰富(图2E)；相反，预后不良组的第4簇基质蛋白丰富(图2E)，每一簇的不同富集表明动态重塑的ECM积极参与疾病进展。接下来，我们试图确定是否可以通过Child Pugh A类早期肝硬化样本中ECM簇的表达来预测肝硬化患者的临床结果。Cox分析表明，簇3和簇4可以预测Child-Pugh分级的进展和患者的存活率。为了避免样本之间的潜在异质性，我们将216个样本随机分成两个数据集，数目相似(107例和109例)，临床病理特征相似。在队列1和队列2中，低簇3和高簇4基质蛋白表达的患者与其他患者(低簇3/低簇4，高簇3/低簇4，或低簇3/高簇4，或高簇3/高簇4)相比，无进展生存时间显著缩短(队列1：HR：3.29(1.44~7.54)，P=0.0047；队列-2：HR：6.06(2.59~14.19),P < 0.0001)。在有或没有低簇3/高簇4基质蛋白表达模式的患者中，Child-Pugh A级早期患者十年进展率分别为44%比12%(队列-1)和65%比27%(队列-2)(图2F)。低簇3/高簇4组患者总生存期明显短于无低簇3/高簇4组患者(队列1：HR：2.46(1.13~5.39)，P=0.024；队列2：HR：8.2 6(3.38~20.2 0)，P<0.0001)。在有或没有低簇3/高簇4基质蛋白表达模式的患者中，Child-Pugh A级早期患者十年生存率分别为64%和84%(队列-1)和38%和80%(队列-2)(图2G)。

图2 在CCl₄诱导的肝纤维化模型中，基质类型的肝蛋白动态重塑，并预测早期肝硬化患者的疾病进展和生存
(A)已鉴定的基质蛋白的蛋白质丰度聚类谱。(B)基质类在每一簇中的分布。(C)每个基质类中簇的分布。(D)每个簇的基因本体(GO)。(E)GSEA分析比较了预后良好和预后差的Child-Pugh A级早期肝硬化活检组织中ECM簇的富集情况。(F、G)根据簇3和簇4ECM信号的表达水平，早期肝硬化患者从Child-Pugh A级进展到B或C级(F)和生存期(G)的概率。

4. 基底膜蛋白对早期肝硬化的预测作用

BMs是位于上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞之下专门的细胞外基质。IV型胶原、层粘连蛋白、基底膜蛋白多糖、巢蛋白、XVIII型胶原和XVI型胶原是BM的核心成分。与受损的组织结构一致，核心BM成分在CCl₄处理1天后下调(图3A)。BMs在1周后部分恢复，在4周CCl₄诱导后完全恢复(图3A)；BMs在肝纤维化和肝硬化中高度上调；预后不良的Child-Pugh A级肝硬化患者组核心BM成分丰富(图3B)。核心BM蛋白在队列中的高表达与较短的无进展时间(队列-1：HR：2.971.38-6.42,P=0.0056；队列-2：HR：5.75.75(2.94-11.24,P<0.0001)和总生存期(队列-1：HR：3.571.71-7.44，P=0.0007；队列-2：HR：3.07P=0.0016)相关(图3C，D)。对于BM蛋白表达高或低的患者，10年生存率分别为63%和90%(队列-1)和43%和85%(队列-2)(图3D)。在肝硬化过程中，临床变量，如胆红素水平和血小板计数，被用来评估肝硬化的预后。多变量Cox分析显示，基底膜信号与Child-Pugh分级(HR：3.191.87~5.42，P<0.0001)和患者死亡(HR：2.571.54~4.30，P=0.0003)有关。高基底膜征象和高胆红素水平均增加了Child Pugh分级进展(HR：10.714.47-25.64，P<0.0001)和患者死亡(HR：6.793.29-14.01，P<0.0001)的风险比，暗示基膜征象和胆红素水平在判断患者预后方面具有互补性。事实上，这两个变量高的患者疾病无进展生存期(P<0.0001)和总生存期(P<0.0001)最短。高BM蛋白表达/高胆红素水平和低BM蛋白表达/低胆红素水平患者的十年Child-Pugh分级进展率分别为62%和4%。高BM蛋白表达/高胆红素水平和低BM蛋白表达/低胆红素水平患者的十年生存率分别为40%和90%。

簇-4和基底膜特征共有14种共同的蛋白质，包括IV、VI、XV和XVI型胶原的α链、层粘连蛋白、集聚蛋白、巢蛋白和HSPG2(图3E)，这14个基因特征在Child Pugh A级肝硬化患者样本预后不良组中高度丰富(图3F)。单变量Cox分析显示，14个基因与疾病进展(HR：3.11，P<0.0001)和患者生存(HR：2.14，P=0.0022)相关。14个基因的高表达与较短的无病程(队列-1：HR：3.71.69-8.14，P=0.0011；队列-2：HR：1.5(1.57-5.82)，P=0.001)和总生存期(队列-1：HR：2.79(1.32-5.88)，P=0.0071；队列-2：HR：1.87(0.94-3.71)，P=0.074)相关(图3g，H)。具有高或低14基因表达的患者的10年Child-Pugh分级进展率分别为32%vs.12%(队列-1)和58%vs.19%(队列-2)(图3C)，具有高或低14基因信号特征的患者的十年生存率分别为65％vs.87％（队列1）和53％vs.80％（队列2）(图3D)。在多变量Cox分析中，14基因特征与Child-Pugh分级(HR：2.83(1.7~4.7)，P<0.0001)和患者死亡(HR：2.07(1.26~3.39，P=0.0042)显著相关。同时存在14个基因标志物和高胆红素水平增加了疾病进展(HR：6.122.75-13.63P<0.0001)和患者死亡(HR：4.011.97-8.20P=0.0001)的风险。高14基因标志物和高胆红素水平的患者无进展生存期(P<0.0001)和总生存期(P<0.0001)最短(P<0.05)。高14基因表达/高胆红素水平和低14基因表达/低胆红素水平患者的十年Child-Pugh分级进展率分别为62%和6%。高14基因表达/高胆红素水平和低14基因表达/低胆红素水平患者的10年生存率分别为43%和88%。

图3 基底膜蛋白在CCl₄诱导的肝纤维化中动态沉积，并预测早期肝硬化患者的疾病进展和生存
(A)GSEA分析比较了肝间质中核心基底膜信号在四个肝纤维化阶段的富集情况。(B)GSEA分析比较预后良好和预后不良的Child-Pugh A级早期肝硬化活检组织中核心基底膜信号的丰富程度。(C、D)根据核心基底膜标记的表达水平，早期肝硬化患者从Child-Pugh A级疾病发展到B级或C级（C）和存活（D）的可能性。(E)Venn图描绘了簇-4特征和基底膜特征的重叠。(F)GSEA分析比较了预后良好和预后差的ChildPugh A级早期肝硬化活检组织中14个基因特征的丰富程度。(G、H)根据14个基因标记的表达水平，早期肝硬化患者从Child-Pugh A级疾病发展到B级或C级（G）和存活（H）的可能性。

5. 次要IV型胶原在肝纤维化的发展中起着重要作用

IV型胶原是BMs维持BM结构所必需的核心成分，在肝脏中表达，并在CCl₄处理4周后高度上调(图4A，B)，有6条高度同源的IV型胶原α链(α1(IV)-α6(IV))，这与人类肝纤维化和肝硬化中IV型胶原积聚的发现一致。IV型胶原α链由α1α1α2(IV)、α3α4α5(IV)和α5α5α6(IV)组成，其中α1α1α2(IV)作为主要的IV型胶原广泛而丰富地表达，而α3α4α5(IV)和α5α5α6(IV)作为次要的IV型胶原以低丰度表达。蛋白质组学分析中鉴定的IV型胶原肽在α1(IV)和α5(IV)链之间保守，主要的IV型胶原α2(IV)链和次要的IV型胶原α5(IV)链都定位于肝脏的肝组织间隙(图4C)，主要的IV型胶原在CCl₄处理1天和1周后没有变化，但在4周CCl₄处理后纤维化病变处积累了(与对照组相比3.2倍)(图4C、D)。在4周的CCl₄处理后，α5(IV)比α2(IV)显著上调(与对照相比是4倍)(图4C、D)，尽管α5(IV)的总信号强度在处理1天后没有改变，但可检测到α5(IV)碎裂的点状结构，与对照组或处理1周或4周后观察到的连续结构不同，表明处理1天后α5(IV)结构被破坏。与α5(IV)不同，α2(IV)在CCl₄诱导的肝纤维化的所有阶段都作为正常的连续结构存在(图4C)。CCl₄诱导的肝纤维化过程中次要IV型胶原表达和结构的动态变化表明，次要IV型胶原在肝纤维化形成过程中可能起着重要的调节作用。

为了研究次要IV型胶原在肝纤维化中的作用，用CCl₄攻击缺乏α5(IV)的小鼠(图4E-H)。经过4周的CCl₄处理后，KO组小鼠的肝纤维化程度明显减轻(图4E-I)，α5(IV)在内皮细胞中表达，α5(IV)与内皮细胞标记CD31部分共存于肝脏(图5A)。据报道，门脉血管生成可以减弱纤维化形成，而肝窦毛细血管化被认为促进了纤维化形成。尽管α5(IV)基因被敲除，但在体外却损害了内皮细胞的增殖，α5(IV)缺乏既不影响门静脉血管生成，也不影响肝窦毛细血管形成。

图4 少量IV型胶原蛋白对于CCl₄诱导的肝纤维化至关重要
(A、B)肝切片上IV型胶原免疫染色，(B)中显示Col IV的定量。N ＝ 3，比例尺：100μm。(C、D)主要IV型胶原α2链和次要IV型胶原α5链免疫组化染色,α-2链和α-5链的定量如(D)所示。N=3(1天和1周)或4(对照和4周)，比例尺：100μm。(E-H)野生型(WT)和Col4α5基因敲除(KO)小鼠腹腔注射CCl₄，连续4周。(E-G)肝切片行苏木精-伊红(HE)、天狼星红染色或I型胶原(ColI)免疫组化染色。天狼星红阳性面积百分比和第I列的数量如(F)，(G)所示。N=3，比例尺：100μm。(H、I)腹腔注射CCl₄ 4周的WT和KO小鼠肝脏中Col I和αSMA的Western印迹分析，量化显示在I中。

6. 次要Ⅳ型胶原调节肝星状细胞活化和肝细胞增殖

在肝细胞损伤诱导的肝纤维化中，肝星状细胞(HSCs)是细胞外基质(ECM)的主要产生者。在CCl₄处理4周后，α5(IV)与肝星状细胞标记物PDGFRα部分共定位(图5A)。在纤维化病变处，α5(IV)在大多数α平滑肌细胞和I型胶原(Col I)阳性活化的HSC中表达(图5A)，而α5(IV)在CSFC-8B HSC细胞中的敲除显著减少了基础和TGF-β诱导的I型胶原和α平滑肌肌动蛋白的表达(图5B)。肺癌细胞中α5(IV)缺乏可导致DDR1表达下降，α5(IV)通过调节DDR1干预细胞增殖。DDR1主要表达于上皮细胞，其家族成员DDR2表达于间充质细胞，虽然DDR1在肝星状细胞中不表达，但在肝损伤过程中，DDR2在肝星状细胞中被诱导表达。DDR2在激活的HSC中被诱导，并且是HSC激活所必需的。TGF-β处理增加了CSFC-8B细胞中DDR2的表达(图5B)。DDR2基因敲除降低了CSFC-8B细胞中Ⅰ型胶原和α平滑肌肌动蛋白的表达(图2)。在α5(IV)缺陷的肝脏中，DDR2的表达显著降低(图4)，α5(IV)在CSFC-8B细胞中的表达显著降低(图5B)，暗示α5(IV)可能通过DDR2调节肝星状细胞活化和肝纤维化。

损伤性肝纤维化是组织损伤和组织修复失衡的结果。α5(IV)缺陷可能促进CCl₄刺激下的功能性肝再生。CCl₄处理4周后，α5(IV)缺乏不影响肝细胞死亡(图5C，D)；然而，在CCl₄处理4周后，α5(IV)缺乏显著增加了Ki67阳性增殖细胞的数量(图5C，D)。在α5(IV)缺陷的肝脏中，持续4周的CCL₄处理后，增殖细胞核抗原和细胞周期蛋白D1的表达持续增加。一旦受到损伤，肝细胞就会增殖以从损伤中恢复。CCl₄处理4周后，在α5(IV)缺乏的肝脏中，HNF4α阳性的肝细胞明显增多(图5E，F)。ERK1/2和AKT信号通路的激活在肝再生中起主要作用。与较高比例的增殖肝细胞一致，α5(IV)缺乏的肝脏在CCl₄处理4周后ERK1/2和AKT的磷酸化显著增加。

图5 少量IV型胶原调节CCl₄诱导的肝纤维化中的肝星状细胞活化和肝细胞增殖
(A)肝脏切片用Col I，αSMA，PDGFRα，CD31和α5（IV）染色。比例尺：100μm。(B)Western blot分析ColI、αSMA、DDR2、α5(IV)和α1(IV)在α5(IV)中的表达，用或不用1 ng/mLTGF-β处理大鼠肝星状细胞系CsFC-8B 48h。(C、D)肝切片进行Ki67或TUNEL免疫染色。(E、F)肝切片免疫组织化学染色Ki67和HNF4α。Ki67⁺及HNF4α⁺肝细胞用白色箭头标出,(F)显示HNF4α⁺肝实质细胞中Ki67⁺细胞的百分率。

讨论

肝硬化仍然是威胁全人类健康的问题。对无症状早期肝硬化诊断的研究的不断深入，对肝硬化预后生物标志物的需求日益迫切，以识别肝硬化高危患者发展为晚期疾病，从而指导诊断后的后续治疗。在本研究中，我们分析了肝基质蛋白在肝纤维化发展过程中的动态变化，并确定基质蛋白信号是早期肝硬化的潜在预后生物标志物，其中次要的IV型胶原在肝纤维化的发展中起着重要作用。

血清生物标记物目前可用于非侵入性评估慢性肝病的肝纤维化，例如：Fibrotest®、AST与血小板比率(APRI)、FibrospectII®、增强型肝纤维化评分®(ELF)。瞬时弹性成像和其他基于肝脏弹性的成像技术测量肝脏硬度为肝纤维化和肝硬化的早期诊断提供了另一种非侵入性方法。尽管这些诊断方法在诊断肝硬化，特别是无症状的早期肝硬化方面取得了成功，但这些诊断方法并不能很好地预测早期肝硬化患者的预后。年龄、性别、血小板计数和天冬氨酸氨基转移酶/丙氨酸氨基转移酶比值与慢性丙型肝炎病毒感染和代偿性晚期肝纤维化的死亡率独立相关。Child-Pugh评分由总胆红素水平、血清白蛋白水平、凝血酶原时间、腹水程度和肝性脑病分级等指标组成，用于评估肝硬化的预后。除了临床变量，基因表达模型还被用来评估复杂疾病的临床结果。据报道，186个预后基因标志可以预测丙型肝炎病毒相关的Child-Pugh A类早期肝硬化患者的疾病进展到晚期肝硬化、患者生存期和肝细胞癌的发展。

肝纤维化是许多慢性损伤的一般伤口愈合反应的一部分。肝纤维化和肝硬化的特征是ECM蛋白的异常沉积。单个细胞外基质成分已被认为是肝纤维化和肝硬化的诊断和预后生物标志物。基质蛋白是186个基因表达模型的一部分，包括胶原、糖蛋白、蛋白酶和分泌因子。弹性蛋白是一种为组织提供弹性的关键糖蛋白，尽管弹性蛋白在正常肝脏中表达较弱，但在肝纤维化晚期有大量沉积，肝脏弹性蛋白含量可预测晚期纤维性肝病的不良结局。弹性蛋白成像使肾纤维化治疗干预的分期和纵向监测成为可能。细胞外基质重塑在组织动态平衡和疾病中具有高度的动态性和复杂性，在这项研究中，我们确定簇3和簇4是早期肝硬化的潜在预后生物标志物。簇3基质蛋白(24个基因)负责纤溶和稳态重构，簇3特征与HCV相关的早期肝硬化患者的良好预后相关(图2)。簇4 ECM信号(52个基因)包括先前报道的调节肝纤维化的核心ECM蛋白，例如胶原、弹性蛋白和富含亮氨酸的小分子蛋白多糖。簇4特征预示丙型肝炎病毒相关的早期肝硬化患者预后不良(图2)，而低簇-3特征和高簇-4特征的患者的疾病无进展生存期和总生存期显著缩短(图2)，强调了平衡的组织修复和纤维化在肝硬化发展中的重要性。

除了簇3和簇4的基因表达模型外，BM特征在预测早期肝硬化疾病进展和患者生存方面也是有效的(图3)。在肝纤维化病变突出的阶段，BMs的成分在肝基质中丰富，包括IV型、XV型、XVII型胶原、层粘连蛋白521、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和聚集蛋白。在簇4和基底膜基因模型中都存在14个基因特征，在预测疾病进展和患者生存方面是有效的(图3)。肝硬化的临床变量被用来评估肝硬化的预后，如胆红素水平和血小板计数。有趣的是，高基底膜信号/14基因信号和高胆红素水平的患者的无进展生存期和总生存期最短，而低基底膜信号/14基因信号和低胆红素水平的患者预后最好(图3)。

IV型胶原是BMs的核心成分，沉积在肝组织间隙，在纤维化的肝脏中表达上调。IV型胶原网络在维持BM结构中是必不可少的，主要和次要的IV型胶原都广泛沉积在纤维化病变上(图3F)。在肝纤维化形成过程中，次要IV型胶原的表达和结构发生了动态变化(图4)，暗示次要IV型胶原可能在调节肝纤维化中起重要作用。少量IV型胶原在活化的肝星状细胞中高表达，缺乏细小的IV型胶原导致肝星状细胞活化减少，肝纤维化明显减轻(图4和图5)；另一方面，次要IV型胶原调节肝细胞增殖和伤口愈合过程(图5)。IV型胶原在肝纤维化发展中的重要作用表明，基底膜的预后价值与其调节肝硬化发展的功能密切相关。次要IV型胶原可能通过非整合素胶原受体DDR2来调节HSC的激活，此前有报道称，DDR2在肝损伤时诱导HSC激活，并介导HSC的激活。IV型胶原以组织特异性的方式结合可溶性糖蛋白、蛋白多糖和生长因子，以建立功能齐全的BM基质细胞。肝细胞生长因子(HGF)是一种来源于HSC的旁分泌因子，通过其受体c-Met及其下游的MAPK和Akt通路，调节肝癌细胞的增殖。次要IV型胶原是否通过HGF和可能的其他生长因子调节肝细胞增殖，值得进一步研究。

综上所述，在急性肝组织损伤/炎症、过渡性ECM重塑和纤维化形成中发现了独特的基质蛋白，这些基质蛋白相关信号通路，特别是基底膜信号，可以预测早期肝硬化进展和患者生存，可能有助于开发生物标志物，从而早期预测肝硬化患者的临床结果。

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https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33558482/

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